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背景：

細胞凋亡（apoptosis）是一種基本生物學(xué)現(xiàn)象，指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細胞自主的有序的死亡，在多細胞生物去除不需要的或異常的細胞中起著必要的作用。在正常活細胞中，磷脂酰絲（PS）位于細胞膜的內(nèi)側(cè)，而在細胞凋亡的早期，PS可從細胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細胞膜的表面，暴露在細胞外環(huán)境中。膜聯(lián)蛋白V(Annexin V) 是一種分子量為35~36KDa的鈣離子依賴型磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力特異性結(jié)合。通過熒光素或者標(biāo)記Annexin V即可簡單快速地直接檢測出細胞早期凋亡情況。 碘化丙啶（propidine iodide，PI）是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜，而早期凋亡細胞的細胞膜是完好的，對PI有拒染性。但在凋亡中晚期的細胞和死細胞，PI能透過細胞膜而使細胞核染上。因此將Annexin V 與PI 匹配使用，就可以將凋亡早晚期的細胞以及死細胞區(qū)分開來。PI可以被488,532或546nm激光線激發(fā)，并發(fā)出紅色熒光。

標(biāo)記：

1.將細胞培養(yǎng)基與EdU溶液按照500：1的比例混合，制成2×EdU標(biāo)記培養(yǎng)基。

2.提前將2×EdU標(biāo)記培養(yǎng)基預(yù)熱，然后將150微升2×EdU標(biāo)記培養(yǎng)基與等體積細胞培養(yǎng)基混合，獲得1×EdU溶液。

【注】：①不建議替換全部培養(yǎng)基，這樣可能會影響細胞增殖的速度。②配置好的培養(yǎng)基建議現(xiàn)用現(xiàn)配，用量以沒過細胞為宜。

3.孵育細胞2 h，棄培養(yǎng)基。

【注】：①培養(yǎng)時間取決于細胞的增殖速度和生長狀態(tài)。②大多數(shù)腫瘤細胞以及粘附細胞系均可采用2 h的孵育時間。

4.以1xPBS清洗細胞兩次，每次5 min, 以除去未摻入DNA的EdU殘留。

【注】：對于貼壁不牢的細胞可降低清洗強度。

實驗步驟：

1. 將細胞以 104-105 個細胞/孔的密度接種在 96 孔板 中，加入 100μL 培養(yǎng)基，含或不含待測化合物。在 CO2 培養(yǎng)箱中在 37℃ 下培養(yǎng)細胞 24 小時。

2. 向板中加入 10μL 不同濃度的待測物質(zhì)。

3. 在培養(yǎng)箱中將培養(yǎng)板培養(yǎng)適當(dāng)時間（如 6、12、24 或 48 小時）。

4. 向板的每個孔中加入 10μL CCK-8 溶液。小心不要將氣泡引入孔中。

5. 將平板在培養(yǎng)箱中孵育 1-4 小時。

6. 在讀板之前，在定軌振蕩器上輕輕混勻。

7. 使用酶標(biāo)儀測量 450nm 處的吸光度。

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