庫蚊通用探針法熒光定量PCR試劑盒實驗規(guī)則：

1、要保證移液槍的準確性，誤差不能超過2%。可用水和電子天平進行確定。但有專業(yè)人員進行矯正。

2、要配備20ul、50ul、100ul、1000ul和排槍各一支。吸取不同的液體后，要更換槍頭。即使是吸取標準品時。

3、要在實驗前1小時將試劑盒從冰箱中取出，使各種試劑都恢復(fù)到室溫，以使結(jié)果更穩(wěn)定。

4、實驗時，要使底物避光保存。

5、用槍吸取液體時速度不能太快，以免產(chǎn)生氣泡而使吸取量不準確。

6、吸取液體時，要用量程和需要量接近的槍去吸，減少誤差。

7、將液體加到酶標孔中時，避免槍頭和孔內(nèi)液體接觸，可使槍頭上的液滴和孔壁接觸，液滴會自然流下去。

8、液體全部加完后，可將酶標板在桌子上平行輕輕晃動30秒，混勻液體。也可以用酶標儀的晃動功能。

9、應(yīng)盡量做雙孔實驗，這樣才能保證數(shù)據(jù)的準確性。

10、對結(jié)果有疑問的樣品要用其它方法進行確證。為確保實驗數(shù)據(jù)的可靠性和可重復(fù)性，實驗人員需嚴格遵守以下補充操作規(guī)范：

11. 反應(yīng)體系配制應(yīng)在超凈工作臺內(nèi)完成，避免氣溶膠污染。所有離心管需預(yù)先標號，并按試劑盒說明書精確配制預(yù)混液，使用前需瞬時離心去除管壁液滴。

12. 加樣順序應(yīng)遵循"由低濃度到高濃度"原則，每加完一組標準品需更換新手套。建議在96孔板邊緣設(shè)置陰性對照孔（加入無核酸酶水）和陽性對照孔（試劑盒提供標準品）。

13. 熱循環(huán)儀需提前預(yù)熱至工作溫度，反應(yīng)板裝載時應(yīng)確保密封膜覆蓋孔口。建議使用離心機對反應(yīng)板進行2000rpm/10秒離心，消除反應(yīng)體系中的微小氣泡。

14. 數(shù)據(jù)分析階段需設(shè)置合理的閾值線，Ct值＞35的樣本應(yīng)視為可疑數(shù)據(jù)。當復(fù)孔Ct值差異＞1.5時，需重新提取核酸進行復(fù)測。所有原始數(shù)據(jù)應(yīng)保存為儀器導(dǎo)出格式和Excel雙備份。

15. 實驗結(jié)束后需立即對工作臺面進行紫外消毒，廢棄槍頭應(yīng)浸泡于10%次氯酸鈉溶液30分鐘。未用完的試劑應(yīng)按說明書要求分裝凍存，避免反復(fù)凍融。

特別提示：當檢測環(huán)境溫度超過28℃時，建議在加樣區(qū)放置冰盒保持試劑低溫狀態(tài)。對于臨界值樣本（Ct值32-35），建議采用巢式PCR方法進行驗證，并將檢測結(jié)果與臨床癥狀相結(jié)合進行綜合判斷。實驗記錄應(yīng)詳細記載每批次試劑的貨號及有效期，以便溯源核查。